诱导表达后细胞超声波破碎实验分享

实验目的

获取蛋白分子量和等电点，推算诱导蛋白分子量：

方法一：

Mr=115*1000/3=38*10³Da

（1个氨基酸的大约分子量为115）

Mr=1*37=37kDa

（1kb DNA对应333个氨基酸，大约37kDa）

方法二：

将氨基酸序列输入特定的软件中，获取蛋白的分子量和等电点性质。

实验材料

LB培养基（Luria-Bertani），PBS缓冲液（phosphate buffered saline），离心机，移液器，超声波破碎仪

实验步骤

诱导前菌体（左）诱导后菌体（右）

利用实验确定的最佳诱导条件进行大量诱导表达，将诱导后的菌液转移到离心管中（15ml），配平后，4000rpm离心5min，弃去上清，收集菌体；

诱导后离心菌体

用等体积PBS缓冲液洗涤菌体1~2次，然后4000rpm离心5min，弃去上清，收集菌体；

超声前（左）超声后（右）

用10ml PBS缓冲液进行悬浮（每1g菌体加入10ml缓冲液），离心洗涤；

将超声发射杆插入菌悬液中，并拧紧夹子，将菌液管固定好，然后将装冰水的烧杯通过托架向上抬起，将菌悬液置于冰水中；

超声条件：功率50W`150W，工作1s，间隙2s，温度控制在30℃以下，冰浴条件下开始超声破碎，超声总时间10~30min；

超声破碎前（左）超声破碎后（右）

超声结束后，取出样品，并用无菌水清洗超声杆；

超声破碎后，菌悬液变轻；

溶液配平后，4℃，12000rpm离心20min；

上清液（左）沉淀（右）

离心结束后，将上清液转移到新的离心管中，作为粗酶液；

取出40μl的粗酶液作为细胞破碎的上清液；

沉淀部分用10ml PBS缓冲液悬浮，然后取出40μl作为细胞破碎沉淀的悬浮液；

将超声波破碎的上清样品与沉淀悬浮样品，放入-20℃冰箱中保存备用；

可溶性蛋白与包含体

SDS-PAGE分析，样品有诱导前、诱导后、破碎、上清、破碎沉淀；

利用可溶性蛋白及超声波破碎细胞的上清液、粗酶液，准备过清和层析柱。

实验结果

获取蛋白分子量和等电点。