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诱导表达后细胞超声波破碎实验分享

文章来源: 上传时间:2022-09-29 浏览次数:

诱导表达后细胞超声波破碎实验分享

实验目的


获取蛋白分子量和等电点,推算诱导蛋白分子量:


方法一:

Mr=115*1000/3=38*10³Da

1个氨基酸的大约分子量为115

Mr=1*37=37kDa

1kb DNA对应333个氨基酸,大约37kDa


方法二:

将氨基酸序列输入特定的软件中,获取蛋白的分子量和等电点性质。


实验材料


LB培养基(Luria-Bertani),PBS缓冲液(phosphate buffered saline),离心机,移液器,超声波破碎仪

LB培养基(Luria-Bertani)PBS缓冲液(phosphate buffered saline)


实验步骤


诱导前菌体(左)诱导后菌体(右)

诱导前菌体(左)诱导后菌体(右)

利用实验确定的最佳诱导条件进行大量诱导表达,将诱导后的菌液转移到离心管中(15ml),配平后,4000rpm离心5min,弃去上清,收集菌体;


诱导后离心菌体

诱导后离心菌体

用等体积PBS缓冲液洗涤菌体1~2次,然后4000rpm离心5min,弃去上清,收集菌体;


超声前(左)超声后(右)

超声前(左)超声后(右)

用10ml PBS缓冲液进行悬浮(每1g菌体加入10ml缓冲液),离心洗涤;


将超声发射杆插入菌悬液中,并拧紧夹子,将菌液管固定好,然后将装冰水的烧杯通过托架向上抬起,将菌悬液置于冰水中;


超声条件:功率50W`150W,工作1s,间隙2s,温度控制在30℃以下,冰浴条件下开始超声破碎,超声总时间10~30min;


超声破碎前(左)超声破碎后(右)

超声破碎前(左)超声破碎后(右)

超声结束后,取出样品,并用无菌水清洗超声杆;


超声破碎后,菌悬液变轻;


溶液配平后,4℃,12000rpm离心20min;


 上清液(左)沉淀(右)

上清液(左)沉淀(右)

离心结束后,将上清液转移到新的离心管中,作为粗酶液;


取出40μl的粗酶液作为细胞破碎的上清液;


沉淀部分用10ml PBS缓冲液悬浮,然后取出40μl作为细胞破碎沉淀的悬浮液;


将超声波破碎的上清样品与沉淀悬浮样品,放入-20℃冰箱中保存备用;


可溶性蛋白与包含体

可溶性蛋白与包含体

SDS-PAGE分析,样品有诱导前、诱导后、破碎、上清、破碎沉淀;


利用可溶性蛋白及超声波破碎细胞的上清液、粗酶液,准备过清和层析柱。


实验结果


获取蛋白分子量和等电点。


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